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炭疽桿菌pagA cap rpoB基因檢測試劑盒(三重熒光PCR)

更新日期: 2022-04-23
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炭疽桿菌pagA cap rpoB基因檢測試劑盒(三重熒光PCR)

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:炭疽桿菌 pagA、cap、rpoB 基因(BaP/C/R)檢測試劑盒(三重熒光 PCR 法) Name:Bacillus Anthracis pagA、cap、rpoB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】

50T/盒

【預期用途】

炭疽是由炭疽桿菌(Bacillus Anthracis, BA)感染引起的一種人獸共患病。BA 在環(huán)境中形成芽孢,可長期、穩(wěn)定地存在于自然界中。由于 BA 的穩(wěn)定性及其致病性,易引發(fā)突發(fā)公共衛(wèi)生事件。目前的 BA 檢測方法主要基于病原體的培養(yǎng)、染色鏡檢、血清學檢測等,但這些方法均不適合早期的快速偵檢。基于核酸檢測的熒光-PCR       技術(shù),因其靈敏度高、操作簡單、特異性好,可快速檢測炭疽病原,及時控制炭疽疫情。

本試劑盒采用探針法實時熒光定量 PCR 技術(shù),用于水皰內(nèi)容物、病灶滲出物、分泌物、痰液、嘔吐物、糞便、血液、腦脊液以及增菌液中炭疽桿菌的定性檢測。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù),對炭疽桿菌的 pagA、cap、rpoB 的基因分別設計特異性引物和特異性探針,用熒光 PCR 技術(shù)對炭疽桿菌的 DNA 進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格

50T/盒

BaP/C/R 反應液

500μL×2 管

酶液

50μL×1 管

BaP/C/R 陽性質(zhì)控品

50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品

250μL ×1 管

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

炭疽水皰內(nèi)容物、炭疽病灶滲出物、分泌物、痰液、嘔吐物、糞便、血液、腦脊液等;

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸, 嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1.  樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1  樣本前處理

組織樣品:每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 200μL 于 1.5mL滅菌離心管中;咽拭子樣品直接取 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2  核酸提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進行核酸提取,請按照試劑說明書進行操作。

2.  試劑配制(試劑準備區(qū))

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性質(zhì)控品+1 管陽性質(zhì)控品),每測試反應體系配制如下表:

試劑

BaP/C/R 反應液

酶液

用量(樣本數(shù)為 N)

20μL

1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,21μL/管。

3.  加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。

4.  PCR 擴增(核酸擴增區(qū))


4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi);

4.2 設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;

熒光通道選擇:檢測通道(Reporter Dye)FAM,Cy5,TXR, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置:

步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時間

收集熒光信號

1

1 cycle

95℃

10min

2

40 cycles

94℃

15sec

55℃

30sec

5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,當曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性質(zhì)控品),重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

FAM 通道為 pagA 基因檢測結(jié)果,Cy5 通道為 cap 基因檢測結(jié)果,TXR 通道為 rpoB 檢測結(jié)果; 陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線;

可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復檢測,如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38,且曲線有明顯的增長曲線, 判定為陽性,否則為陰性;

陰性:樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.  質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無 Ct 值顯示;

陽性質(zhì)控品:擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

7.  檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān);

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

3. 陽性質(zhì)控品、擴增產(chǎn)物泄漏,會導致假陽性結(jié)果;

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結(jié)果;

5. 不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結(jié)果;

6. 試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果;

7. 本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1. 所有操作嚴格按照說明書進行;

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,*混勻并短暫離心;

3. 反應液應避光保存;

4. 反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;

7. 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

8. 試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【生產(chǎn)企業(yè)】

企業(yè)名稱:上海晅科生物科技有限公司


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