人乳鐵蛋白(hLTF)轉(zhuǎn)基因成分熒光PCR試劑盒說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱:人乳鐵蛋白(hLTF)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
Name :Human lactoferrin (hLTF) nucleic acid detection kit (fluorescence-PCR)
【包裝規(guī)格】48T/盒
【預(yù)期用途】
動物源性成分廣泛分布于食品、飼料、化妝品等,與人們的生活息息相關(guān),其中食品和飼料所占的比例大。肉及肉制品摻假成為世界各國共同關(guān)注的熱點問題,肉食品及其飼料的安全隱患直接關(guān)系到人類的安危。近幾十年來,以PCR技術(shù)為核心的動物源性成分檢測獲得了廣泛應(yīng)用。
本試劑盒適用于動物組織以及食品、飼料等樣本中人乳鐵蛋白(hLTF)基因的檢測。
【檢驗原理】
本試劑盒對人乳鐵蛋白(hLTF)基因保守區(qū)設(shè)計特異性的引物和探針[1-3],用熒光 PCR 技術(shù)對核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,從而達(dá)到快速檢測之目的。
【試劑組成】
注:
1)不同批號試劑不能混用。
2)試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次。有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
【標(biāo)本采集】
取動物組織及其制品、食品或飼料約 1g。
【保存和運輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃。但不能超過6個月,標(biāo)本運送應(yīng)采用0℃。
【使用方法】
1.樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1樣本前處理:
取動物組織及其制品、食品或飼料約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中, 8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2DNA 提取
DNA 的提取推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA 提取試劑盒(離心柱提取法),請嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
2.試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。
5.2判斷
a)檢測通道 Ct 值<30.0,有 FAM 熒光信號檢出,并出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線,判斷樣品為陽性。
b)當(dāng) 30.0≤Ct 值≤35.0 時,且有明顯的擴(kuò)增曲線時,則需重復(fù)實驗。再次擴(kuò)增后檢測體系的Ct 值仍≤35.0,且有明顯的擴(kuò)增曲線,則判定該樣品含有相應(yīng)的動物源性成分。當(dāng)再次擴(kuò)增后,檢測體系 Ct 值>35.0,或無明顯的擴(kuò)增曲線,則判定該樣品不含相應(yīng)的動物源性成分。
6.檢測方法的局限性
1)樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān);
2)樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;
3)陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;
4)病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
5)不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
6)試劑運輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或 定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;
7)本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
a)空白對照:無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35.0,未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。
b)陰性對照:無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35.0,未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。
c)陽性對照:有 FAM 熒光信號檢出,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,Ct 值<30.0。
d)以上應(yīng)同時滿足,否則本次實驗無效。
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