黃曲霉B1檢測試劑盒（ELISA方法）

使用說明書

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測谷物、飼料等樣品中的黃曲霉B1（Aflatoxin B1，AFB1），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的黃曲霉B1和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗黃曲霉B1抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含黃曲霉B1含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中黃曲霉B1的殘留量

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.03ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測下限：

谷物……………………………………0.15ppb

食用油、花生…………………………0.6ppb

醬類、麥類、調(diào)料……………………0.3ppb

啤酒……………………………………0.3ppb

葡萄酒、醬油、醋……………………0.15ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

黃曲霉B1…………………………100%

 2.5 樣本回收率：

谷物…………………………………85%±15%

花生…………………………………82±15%

食用油………………………………85±15%

醬類、麥類…………………………83±15%

啤酒…………………………………84±15%

葡萄酒、醬油、醋………………87±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液（黑蓋）：各1ml

0ppb、0.03ppb、0.06ppb、0.12ppb、0.24ppb、0.48ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液：100ppb …………………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋） …………………5.5ml

抗體工作液（藍(lán)蓋） ………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

說明書 ………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：甲醇、正己烷、三氯甲烷或二氯甲烷

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：樣品提取液

70%甲醇，即V甲醇:V去離子水=7：3。

配液2：工作洗滌液

將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 谷物處理方法

1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加5ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；

3）取50μl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：5    檢測下限：0.15ppb

5.3.2 玉米皮、麥麩等吸水性強(qiáng)的樣本處理方法

1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加20ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；（對于毒素含量*的樣本可用35%的甲醇稀釋后再測。比如取2）中的混合液0.1ml加35%的甲醇0.9ml混勻，終樣本稀釋倍數(shù)為200，檢測下限為6ppb。）

3）取50μl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：0.6ppb

注：由于毒素在樣本中的分布呈非均勻狀態(tài)，取樣時需多點(diǎn)取樣充分混勻后再取2g進(jìn)行試驗(yàn)。

5.3.3 食用油、花生油處理方法

1）稱取2ml樣品于50ml離心管中，加8ml正己烷和10ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）去除上層液體，取0.5ml下層液體加入0.5ml去離子水，混勻，再取混勻液體0.5ml加入0.5ml 35%甲醇，振蕩30S；

3）取50μl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：0.6ppb

5.3.4 醬類、麥類、餅干、糕點(diǎn)等食品或調(diào)料處理方法

1）稱取2g粉碎樣品于50ml離心管中，加10ml樣品提取液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取2ml上清，加入4ml三氯甲烷（或二氯甲烷），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

3）轉(zhuǎn)移上層液體到另一容器中，下層液留置備用，向上層液中再加入4ml三氯甲烷（或二氯甲烷），充分振蕩混5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

4）去除上層液體，合并兩次的下層液體并充分混勻；

5）取合并后的下層液體2ml于50-60℃氮?dú)庀麓蹈桑?/p>

6）加入0.5ml樣品提取液充分溶解干燥物，再加入0.5ml去離子水混勻；

7）取50μl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.3ppb

5.3.5 啤酒處理方法

1）將啤酒充分?jǐn)嚢瑁ㄈコ鼵O2），取2ml啤酒樣品，加入1ml蒸餾水，再加入7ml甲醇，振蕩5分鐘；

2）取混勻后的樣品液0.5ml加入0.5ml去離子水，混勻；

3）取50μl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.3ppb

5.3.6 葡萄酒、醬油、醋處理方法

1）取2ml樣品，加入2ml蒸餾水，再加入10ml三氯甲烷（或二氯甲烷），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取下層液體1ml于50-60℃氮?dú)庀麓蹈桑?/p>

3）加入0.5ml樣品提取液充分溶解干燥物，再加入0.5ml去離子水，混勻；

5）取50μl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：5    檢測下限：0.15ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9黃曲霉B1檢測試劑盒（ELISA方法） 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

牛D-乳酸(D-LA)ELISA試劑盒
牛晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)ELISA試劑盒
牛轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)ELISA試劑盒
牛前白蛋白(PA)ELISA試劑盒
牛腫瘤壞死因子γ(TNF-γ)ELISA試劑盒
牛層粘連蛋白(LN)ELISA試劑盒
牛CD63分子(CD63)ELISA試劑盒
牛多殺性巴氏桿菌抗原B2(PM-B2)ELISA試劑盒
牛T2毒素(T-2toxin)ELISA試劑盒
牛玉米赤霉烯酮(ZEN)ELISA試劑盒
牛黃曲霉(AFT)ELISA試劑盒